A Diretiva 2000/60/CE, também conhecida como Diretiva Quadro da Água (DQA), tem como objetivo a proteção dos meios aquáticos, garantindo que, no espaço europeu, todas as massas de água alcancem um bom estado ecológico. O Real Decreto 817/2015 define quando esse “bom estado ecológico” é considerado atingido: ocorre quando os valores apresentam baixa desviación relativamente às condições biológicas de referência, ou seja, às melhores condições possíveis. Para avaliar o estado ecológico das massas de água, são necessários estudos de biomonitorização, cujo elemento central são os indicadores biológicos.

Entre os bioindicadores propostos, as algas fitobentónicas e os invertebrados bentónicos ocupam um lugar de destaque devido às suas características fisiológicas e ecológicas, que os tornam organismos ideais para serem utilizados como indicadores ecológicos. No âmbito dos programas de biomonitorização dos ecossistemas aquáticos, a avaliação da composição taxonómica e da abundância das comunidades de organismos bioindicadores é essencial para compreender a função e a estabilidade dos ecossistemas e para preservar os serviços que estes organismos proporcionam (Stegen & Hurlbert 2011; Kermarrec et al. 2013).

No entanto, a biomonitorização também tem sido criticada pelo facto de, baseando-se normalmente em critérios morfológicos para a identificação das comunidades, exigir muito tempo e elevada especialização taxonómica. Por esse motivo, na última década surgiram novas metodologias baseadas em ADN, como o metabarcoding, que permitem a identificação simultânea de múltiplos táxones a partir de amostras de organismos ou de amostras ambientais. Uma aplicação relativamente recente do metabarcoding é a caracterização do eDNA (environmental DNA ou ADN ambiental), ou seja, ADN extraído mais frequentemente de amostras ambientais como água ou solo.

O que é o eDNA?

O eDNA é essencialmente uma mistura de ADN que se origina dos organismos que hambitam – ou habitaram recentemente – um determinado ambiente e que permanece livre no meio ou adsorvido a partículas, por exemplo no sedimento. Varios estudos já demonstraram o potencial do metabarcoding para a valiação do estado ecológico das massas de água através da utilização de comunidades de organismos bioindicadores (Kermarrec et al., 2014; Visco e al., 2015; Zimmermann et al., Pawlowski et al., 2016).

No entanto, un problema associdado à técnica de metabarcoding é a ausência, para alguns táxones, de bases de dados de sequências de refêrencia completas e validadas, essenciais para atribuir sequências ambientais de espécimes cesconhecidos a espécies conhecidas. Por isso, é fundamental garantir que os códigos de barras de ADN das espécies presentes nas amostras de água estejam incluídos nas bibliotecas de referência, permitindo uma identificação taxonómica precisa ao nível da espécie.

Situação na Península Ibérica em relação às diatomáceas e crustáceos bentónicos

Na Península Ibérica, existem condições ambientais mais exigentes para a flora e fauna aquática continental, especialmente na vertente mediterrânica (Gasith & Resh, 1999). Há também fatores históricos específicos (Bonada et al., 2004) que influemciam a composição e evolução destes ecossistemas. Como resultado, observa-se uma mior diversidade faunística e uma alta taxa de endemismo. Além disso, a vaiedade de impactos que afetam as massas de água tem aumentando nos últimos anos, o que pode ampliar ou reduzir significativamente os intervalos de tolerância das espécies.

No sul da Península encontramos massas de água sujeitass a processos de evaporação muito intensos. Durante a época de estiagem, estas massas de água sofrem uma redução natural e significativa do caudal, chegando mesmo a desaparecer durante meses. Um exemplo claro deeste tipo de ambientes encontra-se na bacia do rio Guadiana, que combina diferentes tipos de litologia, conferindo à água um caráter mais ácido ou mais básico, consoante o substrato por onde circula. Estas condições variáveis influenciam diretamente a elevada diversidade de organismos presentes na região.

As diatomáceas

Os organismos que habitam estes sistemas tão variáveis devem apresentar adaptações especiais para sobreviver a ambientes tão extremos. As diatomáceas são um tipo de microorganismo essencial na Diretiva Quadro da Água, sendo utilizadas para a avaliação da qualidade da água a nível europeu. Estes organismos são fortemente influenciados pelas variações de caudal e pelas características físico-químicas destas redes fluviais.

Quando se trabalha em sistemas tão irregulares e sujeitos a fortes pressões ambientais, a avaliação do estado ecológico nem sempre reflete com precisão a realidade. Isto acontence porque, após períodos de estiagem intensa, surgem espécies que atuam como primeiras colonizadora, instalando-se rapidamente quando o caudal regressa. Estas espécies podem gerar valores artificalmente elevados nos índices de qualidade, por serem típicas de ambientes pobres em nutrientes, mas altamente eficientes na colonização inicial. Un exemplo claro é Achnanthidium minutissimum, que frequentemente se desenvolve de forma dominante sobre os restantes táxones da comunidade de diatomáceas. A sua abundância não resulta tanto da concentração de nutrientes, mas sim da sua capacidade superior para ocupar rapidamente o espaço disponível e da ausência de competição após o período de seca. Assim, o resultado final dos índices ecológicos pode ser enganador, representando mais a dase de recolonização do habitat do que a verdadeira qualidade da água.

Adaptar os índices de diatomáceas

Encontram-se também outras espécies raras ou pouco frequentes noutras redes fluviais, devido ás particularidades destes sistemas, cuja ecologia é ainda pouco conhecida. Por isso, determinar com maior precisão o estado ecológico destes ecossistemas é fundamental para a aplicação da Diretiva Quadro da Água. Assim, o exposto anteriormente confirma a necessidade de adaptar os índices de diatomáceas aos rios típicos da região mediterrânica.

Os índices de diatomáceas exigem uma identificação taxonómica precisa das comunidades. O objetivo é evitar identificações incorretas que comprometam a precisão de um índice de diatómaceas para a avaliação de qualidade da água (Besse-Lototskaya et al. 2006). Por isso, tornou-se cada vez mais relevante encontrar alternativas que respondam às limitações do método tradicional. Assm, o uso do metabarcoding de ADN surge como uma solução altamente promissora para avaliar de forma rápida a diversidade de diatomáceas nos corpos de água, permitindo obter de forma ágil uma “lista de espécies” presentes numa amostra.

Os crustáceos bentónicos

Otro grupo de indicadores ecológicos de grande interesse, além das diatomáceas, está representado pelos crustáceos bentónicos. Estes são os branquiopodes, copépodes e otracodes. Utilizam-se para a determinação do índice ABCO para a classificação do estado ecológico em lagos segundo o estabelecido pela DQA. Em efeito, as comunidades destes invertebrados bentónicos têm características ecológicas e fisiológicas. Estão presentes em todas as tipologias das massas de água da categoria lago. Também apresentam um ciclo fechado nos ambientes aquáticos e respondem às perturbações do habitat. Isto torna-os idóneos para o seu uso na avaliação da qualidade da água dos lagos.

No entanto, devido à sua complexidade morfológica, a identificação ao nível de espécie destes organismos é complexa e problemática, exigindo a presença de taxonomistas altamente especializados. Por isso, o desenvolvimento de protocolos moleculares para a identificação das comuidades de crustáceos bentónicos em lagos, baseados na aplicação do eDNA, representaria uma grande vantagem face ao método tradicional, tanto em termos de rapidez como de eficiência na obtenção do índice de qualidade.

Por todo ello, no presente projeto pretende-se combinar a abordagem morfológica tradicional com a abordagem molecular. O objetivo é desenvolver e validar protocolos baseados em técnicas de metabarcoding para a biomonitorização de rios e lagos mediterrânicos, permitindo a obtenção dos índices de diatómaceas e ABCO.

O aspeto mais inovador deste projeto está representado pelo desenvolvimento de protocolos de metabarcoding para a sua aplicação em programas de biomonitorização da qualidade da água baseados em diatómaceas e crustáceos bentónicos. A integração ou aplicação rotineira destas técnicas moleculares na realização de estudos de avaliação do estado ecológico em Espanha implica uma poupança económica e um ganho de tempo significativo. Além disso, coloca a Eurofins Cavendish, S.L. numa posição de liderança no setor, sendo a primeira empresa a realizar este tipo de análises.

Outro grande avanço apresentado neste projeto está representado pelo desenho de um novo índice de diatomáceas bentónicas adaptado para bacias com influência mediterrânica. Este índice ajustar-se-ia muito melhor ao tipo de pressões ambientais próprias deesta área, representando uma redução do tempo de identificação e, consequentemente, uma optimização dos recursos.